成果更新:

(1)本项目资助下完成的细菌T3SS鉴定和比较分析、效应蛋白鉴定和转录调控单元分析论文于2017年4月被微生物生态学顶级期刊Environmental Microbiology正式接受发表Pubmed]。

(2)本项目资助下完成的鼠疫杆菌YopM家族效应蛋白结构和功能分析论文于2016年5月被美国微生物学协会旗下top期刊Infection and Immunity接受发表Pubmed]。

(3)本项目资助下完成的沙门氏菌YiiG家族效应蛋白结构和功能分析论文于2017年1月被中文核心期刊基础医学与临床接受发表链接]。

(4)本项目资助下完成的细菌成簇串联重复序列鉴定方法论文于2017年1月被中文核心期刊基础医学与临床接受发表链接]。

(5)本项目资助下完成的细菌IV型分析效应蛋白预测软件开发的论文于2014年被SCI期刊BMC Genomics接受发表Pubmed]。

项目简介

本项目为国家自然科学基金青年基金项目,编号为81301390,起止日期:2014.01.01-2016.12.31。原课题为:八个新鉴定的沙门氏菌III型分泌效应蛋白的功能研究。依托单位:深圳大学。

课题背景:

(1)沙门氏菌是重要的人体、禽、畜致病菌,是人类伤寒的致病原,严重影响人类的健康。抗生素的发现及使用,使得伤寒的发病率和死亡率急剧降低。但是,一方面,随着最近细菌耐药的频繁发生(例如致死率极高的“超级细菌”的爆发), 这些细菌重新引起国际社会的重视;其二,在广大的农村、山区和卫生状况较差的地方,沙门氏菌感染引起的肠炎和伤寒仍然高频发生,进而对人们生活质量造成的影响和国家医疗负担的增加,仍然不可忽略;第三,沙门氏菌的血清型 和宿主较广,不仅引起人体感染,还致使各种家禽、家畜的感染,从而造成一定的经济损失;最后,我们对沙门氏菌致病性机理的认识仍然非常有限,对其致病机理的更加深入系统理解,将促进我们对生命体进化、致病性进化、各种细 菌感染性疾病发生的认识和有效防控。

(2)III型分泌系统和效应蛋白。沙门氏菌致病与细菌编码的两套蛋白分泌系统密切相关,分别叫做致病岛1-和致病岛2-III型分泌系统。沙门氏菌的染色体长度一般为4-5M,细菌毒性编码的基因经常成簇聚集于染色体的一些区段,这些 区段常称作“致病岛”(Pathogenicity Island, 缩写PI),而沙门氏菌基因组中也有多个致病岛(Salmonella Pathogenicity Island,缩写SPI);在沙门氏菌致病岛1和致病岛2(SPI1和SPI2)各编码一套III型分泌系 统。III型分泌系统(Type III Secretion System,简写为T3SS),顾名思义,即“第三种分泌系统”,这里我们主要讨论的是细菌蛋白质分泌系统。细菌有多种蛋白分泌系统,例如革兰阴性和阳性细菌共有的I、II、IV、V型, 革兰阴性细菌特异的III、VI型,革兰阳性细菌中特异的VII型,以及最近发现的其它一些类型等。罗马数字多是与该类蛋白分泌系统在细菌中发现的先后有关。在这些分泌系统中,III型、IV和VII型多跟细菌的致病性密切相关;VI 型不仅和致病性关系密切,还和细菌不同群体之间的竞争有关。III型分泌系统是指一种由多基因编码的蛋白复合体,在细菌的表面组装成一中空的针管样结构;该针管样结构的底座跨过细菌细胞的内外膜,而针尖则可以刺穿人体/其 它宿主细胞膜。当细菌接触宿主细胞时,这种接触信号会触发细菌III型分泌系统基因的表达,从而在菌体表面进行针管结构组装,并刺穿宿主细胞膜;进一步地,细菌菌体内编码的一些毒性蛋白可以被这些管道特异识别并转运到宿主 细胞内,引起宿主细胞病变。这些经过III型分泌系统管道进入宿主细胞胞桨的毒性蛋白,称作效应蛋白(effector)。沙门氏菌从肠道入侵到人体/其他宿主肠道上皮细胞中,主要是依靠SPI1 T3SS;而当细菌入侵机体后在人体长 期生存、感染阶段,则主要通过SPI2 T3SS发挥作用。

(3)沙门氏菌III型分泌系统和效应蛋白研究的背景和意义。沙门氏菌致病性和两套T3SS密切相关,但是具体的发病机理仍然有待于进一步明确。下面的一系列问题截止目前仍然未知,深入探讨这些问题并给予解答,将非常有 助于我们理解和控制沙门氏菌乃至其它细菌的致病:沙门氏菌有多少T3SS效应蛋白?目前还有多少没有得到鉴定?这些效应蛋白对于细菌致病性具体发挥着怎样的功能?这些效应蛋白的来源是什么、如何进化的?T3SS的来源是什么、 如何进化的?效应蛋白是如何被T3SS特异识别、并分泌和转运的?不同的细菌T3SS及其效应蛋白有怎样的差异?这些差异和细菌表型差异是否有关联?细菌如何衍生出如此多的分泌系统?这些分泌系统之间有怎样的功能互补性?T3SS 的进化和细菌基因组的进化间有怎样的关联?T3SS及其效应蛋白是如何一步步整合进细菌的基因组中的?T3SS以及效应蛋白与宿主之间是如何共进化的?

研究目标:

(1)初始研究目标:八个前期鉴定的沙门氏菌 III 型分泌效应蛋白的功能。

(2)调整后目标:1)III 型分泌效应蛋白 SlrP、YiiG 和 SteA 的功能研究; 2)细菌 III 型分泌系统以及效应蛋白全面比较和注释; 3)沙门氏菌基因组和 III 型分泌系统进化分析; 4)细菌 III 型、IV 型、VI 型分泌效应蛋白的高效预测。

(3)目标调整的解释:与原目标相比,调整后的目标 1)从“八个”减少到“三个”效应蛋白,主 要原因:项目执行前的预研究(Wang et al., 2013)鉴定了八个候选沙门氏菌 III 型分泌效应蛋白,本项目即立足于这八个候选蛋白。但是,原研究中转运分析只 是基于相应基因的氨基端转运信号肽,而并非全长蛋白。项目施行过程中,需要 克隆和分析这些基因的全长编码序列,但是发现多数(6 个)氨基端片段可以经 III 型分泌系统分泌、但全长则无法分泌。我们采用研究较为充分的沙门氏菌 III 型分泌效应蛋白 SopB 和 SteA,克隆其不同长度的片段进行分泌和转运分析,得 到了类似的观察(参考本项目 2015 年进展报告)。另外,项目负责人参与的另一 课题“过氧化物酶体定位信号分析”也有类似的发现(Wang et al., in press)。一 方面,这一意外是项目申请和施行早期不可预期因素,实际上属于一个新的发现; 另一方面,因为“这八个蛋白是经 III 型分泌系统转运的效应蛋白”是项目的基 础,如果失去这一基础,原计划将无法往下进行。因此,我们将“八个”减少到 “两个”效应蛋白的功能分析(SlrP 和 YiiG)。对于 SteA,本身目的是用于效应 蛋白转运体系分析的阳性对照以及“全长和氨基端信号序列经 III 型分泌系统转 运差异”的验证蛋白,但是,研究中有一个意外发现:SteA 的 N 末端和全长蛋 白都可以介导其经 III 型分泌系统分泌和转运,但是中间片段却不可以(参考本 项目 2015 年进展报告);课题组讨论后认为进一步对这一现象和机理的探讨可能 对于细菌 III 型分泌/转运识别机理有较好的促进意义,因此将对 SteA 的研究也 增加为调整后的目标。对于调整后的三个效应蛋白的研究,均顺利完成既定目标。 除了总体上忠实于原研究计划的目标 1),我们又增加了三个新的研究目标。 这三个目标均与原计划密切相关,也是在本研究基金的资助下完成(均为唯一或 首要资助,相关论文等材料均已标注或将标注第一资助)。截至目前,围绕着这 三个卫星目标,均已经取得了良好的研究成果。

研究内容:

1)III 型分泌效应蛋白 SlrP、YiiG 和 SteA 的功能研究

a. SlrP、YiiG 和 SteA 的全长转运、表达诱导分析
b. SlrP 蛋白家族(LRR 蛋白家族)的进化、分布和功能分析
c. YiiG 蛋白家族进化、分布和功能分析
d. SteA 的分泌/转运机理分析

2)细菌 III 型分泌系统以及效应蛋白全面比较和注释

a. 细菌 III 型分泌系统以及效应蛋白的系统比较分析
b. 细菌 III 型分泌系统数据库建立

3)沙门氏菌基因组和 III 型分泌系统进化分析

a. 沙门氏菌基因组进化和 III 型分泌系统进化分析
b. 细菌染色体极性对称进化分析
c. 肠杆菌核心基因组分析

4)细菌 III 型、IV 型、VI 型分泌效应蛋白的高效预测

a. III 型分泌系统效应蛋白预测
b. IV 型分泌系统效应蛋白预测
c. VI 型分泌系统数据库注释和效应蛋白预测



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